革蘭氏陽性菌質粒大量提取試劑盒說明書
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
操作步驟：
1、取50-200ml 細菌培養(yǎng)物，11000rpm離心5min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。
2、向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml 溶液Ⅰ和1ml 溶菌酶，混勻。37℃水浴30 min 以上（根據(jù)菌液量可適當加長水浴時間，請先檢查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。
3、向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和以免污染基因組DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過5 min，以免質粒受到破壞。
4、向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。11000rpm離心10 min ，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，11000rpm 離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分兩次吸附) 。
6、向吸附柱中加入8ml 漂洗液( 使用前請先檢查是否已加入無水乙醇) ，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入6ml 漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8、11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去
除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)實驗如酶切、PCR 等。
9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加 1-2ml 經(jīng)65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質粒DNA溶液。
10、（可選）為了增加質粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。
注意事項：
1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復澄清后再使用。
2、洗脫緩沖液體積不應少于500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH 值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其 pH值在8.0左右( 可用NaOH 將水的pH值調(diào)此范圍) ，pH值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應保存在-20 ℃，以防DNA降解。
3、如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用400-800ml培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間，以增加提取效率。
4、DNA濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰， OD260 值為1 相當于大約50 μg/ml 雙鏈DNA、40 μg/ml 單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9 ，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。
相關產(chǎn)品：
E1020 EB染色液
D1010 6×DNA Loading Buffer
T1060 50×TAE 緩沖液
T1050 5×TBE 緩沖液
M1060 D2000 DNA Ladder
M1400 1kb DNA Ladder
G8142 GoldView II型核酸染色劑(5000×)
L1015 LB固體培養(yǎng)基(干粉)
L1020 SOC液體培養(yǎng)基(干粉) |
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